關(guān)于印發(fā)《SARS病毒滅活疫苗臨床前研究技術(shù)要點(diǎn)》等技術(shù)要求的通知

各省、自治區(qū)、直轄市藥品監(jiān)督管理局：

為加強(qiáng)SARS診斷試劑、疫苗以及防治藥物篩選研發(fā)工作的管理，規(guī)范技術(shù)研究及實(shí)驗(yàn)方法，確保研究結(jié)果真實(shí)可靠，我局組織制定了《SARS病毒滅活疫苗臨床前研究技術(shù)要點(diǎn)》、《細(xì)胞模型篩選抗SARS病毒藥物試驗(yàn)技術(shù)要求》、《SARS診斷試劑生產(chǎn)研制技術(shù)要求》及《SARS病毒毒株資料登記表》等技術(shù)要求，現(xiàn)予印發(fā)，請(qǐng)從事SARS防治藥物研發(fā)的單位遵照?qǐng)?zhí)行，并就相關(guān)問題通知如下：

一、從事SARS疫苗研究、診斷試劑研制和有關(guān)藥物篩選等工作的單位，在執(zhí)行相關(guān)技術(shù)要求的同時(shí)，必須嚴(yán)格按照科學(xué)技術(shù)部、衛(wèi)生部、國家食品藥品監(jiān)督管理局和國家環(huán)境保護(hù)總局四部局聯(lián)合頒發(fā)的《關(guān)于印發(fā)〈傳染性非典型肺炎病毒實(shí)驗(yàn)室暫行管理辦法〉和〈傳染性非典型肺炎病毒的毒種保存、使用和感染動(dòng)物模型的暫行管理辦法〉的通知》（國科發(fā)農(nóng)社字〔2003〕129號(hào)）要求保存和使用SARS病毒毒株，任何單位不得擅自進(jìn)行毒株的轉(zhuǎn)讓。因SARS 病毒毒株保存或者使用不當(dāng)引起嚴(yán)重后果者，將承擔(dān)相應(yīng)的法律責(zé)任。

二、各藥物研究開發(fā)單位應(yīng)按照《SARS病毒毒株資料登記表》的要求整理有關(guān)毒株的詳細(xì)資料，于2003年7月31日前報(bào)中國藥品生物制品檢定所（北京天壇西里2號(hào)，郵編100050；聯(lián)系人：董關(guān)木；聯(lián)系電話：010-67058428）。未按規(guī)定要求提交SARS病毒毒株資料的，國家食品藥品監(jiān)督管理局將不受理其研發(fā)制品的注冊(cè)申報(bào)和審批。

三、中國藥品生物制品檢定所接到各單位報(bào)送的SARS病毒毒株資料后，應(yīng)及時(shí)審核并將審核意見和進(jìn)行藥物研究用毒種的基本情況，書面報(bào)國家食品藥品監(jiān)督管理局。

四、請(qǐng)各省、自治區(qū)、直轄市藥品監(jiān)督管理局盡快將本通知轉(zhuǎn)發(fā)至轄區(qū)內(nèi)從事SARS防治藥物研究開發(fā)單位。

特此通知

附件：1．SARS病毒滅活疫苗臨床前研究技術(shù)要點(diǎn)

2．細(xì)胞模型篩選抗SARS病毒藥物試驗(yàn)技術(shù)要求

3．SARS診斷試劑生產(chǎn)研制技術(shù)要求

4．SARS病毒毒株資料登記表

國家食品藥品監(jiān)督管理局

二○○三年七月一日

附件1：

SARS病毒滅活疫苗臨床前研究技術(shù)要點(diǎn)

隨著對(duì)非典型肺炎的病原學(xué)、流行病學(xué)、診斷和治療等學(xué)科進(jìn)行全面深入的研究，在各領(lǐng)域已取得重要進(jìn)展，尤其是確定了SARS病毒為其病原體，已成功分離到多株SARS病毒，并已驗(yàn)證其能在Vero細(xì)胞和2BS等細(xì)胞系中培養(yǎng)增殖，這為研制疫苗提供了基礎(chǔ)和基本條件。但是由于SARS病毒的研究有待進(jìn)一步深入，疫苗的研制尚存在很多的不確定因素。為使SARS病毒滅活疫苗的臨床前研究工作科學(xué)規(guī)范，特制定SARS病毒滅活疫苗臨床前研究考慮要點(diǎn)。

一、毒種

研究本疫苗所用的毒種須證明為SARS病毒，如該毒種分離自人體，須提供以下資料

（一）病毒株名稱及來源

1．名稱

2．宿主情況：

（1）病人姓名、年齡、性別、民族、家庭住址；

（2）發(fā)病地點(diǎn)、發(fā)病日期；

（3）收住入院日期、臨床確診日期、實(shí)驗(yàn)室確診日期；

（4）病人病程及病人轉(zhuǎn)歸：死亡、痊愈、是否有后遺癥；

（5）毒株分離原樣本：

咽試子、漱口液、痰液、血液、糞便或尸解標(biāo)本組織名稱；

（6）取樣日期；

（7）取樣時(shí)病人的病期；

（8）取樣地點(diǎn)；

（9）病人是否留有恢復(fù)期血清；

如有：采血日期（病期）和血清量；

鑒于人類咽試子、漱口液、痰液、糞便等樣品難免污染其他外原因子，因此建議盡可能采用病人血液分離的病毒株。

（二）毒株分離過程

1．用細(xì)胞分離病毒，須提供所用細(xì)胞名稱、代次、來源和細(xì)胞無菌檢測(cè)、外原因子檢測(cè)等資料；鑒于Vero E6細(xì)胞的生物學(xué)特性，用Vero E6細(xì)胞分離的SARS病毒不能直接用于疫苗生產(chǎn)用毒種，須將Vero E6細(xì)胞的適應(yīng)株重新轉(zhuǎn)適應(yīng)到Vero細(xì)胞或二倍體細(xì)胞株的毒種方能用于生產(chǎn)，因此建議盡可能使用直接以Vero細(xì)胞或二倍體細(xì)胞株分離的毒種。

2．通過動(dòng)物分離病毒，須提供所用動(dòng)物名稱、動(dòng)物品系、動(dòng)物級(jí)別、動(dòng)物年齡和制備毒種的動(dòng)物臟器名稱等資料；如再適應(yīng)到細(xì)胞，則還須提供1．項(xiàng)所述的細(xì)胞資料。

（三）病毒分離傳代特性

樣品處理方法、首次盲傳確證病毒陽性代次、病毒確證檢定方法、每代培養(yǎng)天數(shù)、病毒滴度、滴定方法、動(dòng)物是否發(fā)病或死亡等資料。

（四）毒種建立和保存

原始毒種代次、毒種病毒滴度、毒種添加的保護(hù)劑的名稱和濃度、毒種存儲(chǔ)條件。

毒種批的建立應(yīng)按《中國生物制品規(guī)程》疫苗毒種要求進(jìn)行，應(yīng)建立原始毒種、主毒種和工作毒種批三級(jí)毒種庫，主種子和工作種子批還須有毒種的限定代次的資料，以證明主種子和工作種子批在規(guī)定代次內(nèi)的生物學(xué)特性與原始毒種一致。

（五）毒種的檢定

1．毒種的鑒別試驗(yàn)：

應(yīng)提供檢定方法、檢定日期、檢定結(jié)果等資料，建議采用下述方法進(jìn)行鑒別試驗(yàn)：

（1）可使用確診為SARS病人的恢復(fù)期高效價(jià)血清中和病毒。

（2）測(cè)定中和前后的病毒滴度。

（3）應(yīng)有病毒株的核酸全序列分析的資料，包括序列測(cè)定的方案、測(cè)定方法和測(cè)定結(jié)果，測(cè)定結(jié)果應(yīng)附核酸序列圖、推導(dǎo)的氨基酸序列圖、種系發(fā)生樹圖等以進(jìn)一步證明為SARS冠狀病毒。

2．毒種的無菌試驗(yàn)

應(yīng)根據(jù)《中國生物制品規(guī)程》疫苗生產(chǎn)用毒種的要求進(jìn)行無菌試驗(yàn)檢查。

3．毒種的外源因子檢查

應(yīng)用證明為SARS病毒感染的單人份病人血清中和本病毒。完全中和病毒后（如不能一次中和，可用另一病人血清再一次中和后）按下列方法進(jìn)行動(dòng)物和細(xì)胞檢查。

（1）動(dòng)物試驗(yàn)法

小鼠

取15-20g小鼠至少10只，用經(jīng)中和后的病毒懸液，每只腦內(nèi)接種0．03ml，腹腔接種0．5ml。至少觀察21天。解剖所有在試驗(yàn)24小時(shí)后死亡或有患病體征的小鼠，為了檢查病毒感染的證據(jù)，直接肉眼觀察其病理改變，并將有病變的相應(yīng)的組織懸液通過腦內(nèi)和腹腔接種另外至少5只小鼠并觀察21天。如果沒有小鼠表現(xiàn)出病毒感染現(xiàn)象，則病毒種子符合要求。在觀察期內(nèi)至少有80%最初接種的小鼠存活試驗(yàn)才有效。

乳鼠

出生后24小時(shí)以內(nèi)的乳鼠，至少10只，用經(jīng)中和后的病毒懸液，腦內(nèi)接種0．01ml，腹腔接種至少0．1ml。每天觀察，至少14天。解剖所有在試驗(yàn)24小時(shí)后死亡或有患病體征的小鼠，直接肉眼觀察其病理改變，并取有病變的相應(yīng)的組織和腦、脾制備成懸液腦內(nèi)和腹腔接種另外至少5只小鼠并每天觀察，觀察14天。如果沒有小鼠表現(xiàn)出有病毒感染現(xiàn)象，該病毒種子通過試驗(yàn)。在觀察期內(nèi)至少有80%最初接種的小鼠存活試驗(yàn)才有效。

（2）細(xì)胞培養(yǎng)法

·非血吸附病毒檢查

中和后的病毒懸液，還應(yīng)分別接種于人源、猴源和生產(chǎn)用的同種不同批的細(xì)胞。如果是利用人二倍體細(xì)胞生產(chǎn)的，還應(yīng)接種另外一株人二倍體細(xì)胞。每種細(xì)胞最少接種6瓶，每瓶病毒懸液接種量不少于培養(yǎng)液總量的25%。于36±1℃培養(yǎng)，觀察二周，或最后一次收獲病毒液時(shí)間檢查是否有CPE出現(xiàn)。未見CPE為陰性。

·血吸附病毒檢查

于第6-8天和第14天，每種細(xì)胞分別各取出2瓶進(jìn)行血吸附，一瓶放置2-8℃，一瓶放置20-25℃，30分鐘后顯微鏡下觀察，未見血球吸附現(xiàn)象為陰性。

特別注意：鑒于我國實(shí)驗(yàn)室條件和所用細(xì)胞的不確定因素，用于分離病毒的細(xì)胞常常污染支原體，而細(xì)胞和病毒一旦污染支原體很難清除，為此，提醒對(duì)使用的毒種須高度重視，徹底查清毒種是否確已污染支原體，以免所選毒種不符合生產(chǎn)疫苗用毒種，浪費(fèi)人力、物力、時(shí)間和資源。

4．毒種的病毒滴度

鑒于目前的研究資料顯示，SARS病毒在Vero細(xì)胞中的復(fù)制滴度一般可達(dá)108，在二倍體細(xì)胞中為106左右，用于疫苗研究的毒種應(yīng)分別達(dá)到上述要求。

5．毒種免疫原性檢查

鑒于目前尚無測(cè)定疫苗免疫原性的有效方法和標(biāo)準(zhǔn)，建議以實(shí)驗(yàn)性滅活疫苗（即用已建立的毒種庫制備的滅活病毒液）單次或多次免疫動(dòng)物后采血清測(cè)定中和抗體滴度，測(cè)定方法應(yīng)為蝕斑形成減少法或細(xì)胞病變抑制法，可能時(shí)應(yīng)對(duì)所測(cè)抗體的種類進(jìn)行分析。用于中和抗體測(cè)定的病毒株應(yīng)為非同源株，免疫用動(dòng)物可考慮家兔、小鼠、豚鼠或其他敏感動(dòng)物。如有條件時(shí)也可測(cè)定疫苗的ED50

6．疫苗候選株病毒的純化問題

新分離的病毒往往是群體病毒毒種，難免存在不同特性的病毒，如毒種病毒滴度和免疫原性未達(dá)要求，必要時(shí)可考慮用終末稀釋法或蝕斑形成法挑斑反復(fù)多次純化。滅活疫苗的研制，如毒種病毒滴度和免疫原性能達(dá)到基本要求，可用現(xiàn)有毒種直接制備實(shí)驗(yàn)性疫苗，無須純化。

7．毒種的其他檢定

按《中國生物制品規(guī)程》疫苗生產(chǎn)用毒種的要求進(jìn)行

二、疫苗生產(chǎn)用細(xì)胞

鑒于目前SARS病毒對(duì)各種細(xì)胞的敏感性研究，以Vero E6細(xì)胞最好，Vero細(xì)胞和二倍體細(xì)胞次之。但Vero E6細(xì)胞不能用于生產(chǎn)，可選擇Vero細(xì)胞、和/或二倍體細(xì)胞進(jìn)行研究。

Vero細(xì)胞、二倍體細(xì)胞均為傳代細(xì)胞，因此須建立三級(jí)細(xì)胞庫。這兩種細(xì)胞建立細(xì)胞庫和各細(xì)胞庫的各項(xiàng)檢定應(yīng)按《中國生物制品規(guī)程》“生物制品生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞制備及檢定規(guī)程”項(xiàng)下的相應(yīng)要求進(jìn)行。

Vero細(xì)胞是由非洲綠猴腎建立的傳代細(xì)胞系，至170代以后已有明顯的致瘤性，一般使用的疫苗生產(chǎn)終末安全代次為160代以前，建議使用Vero細(xì)胞研制疫苗的機(jī)構(gòu)應(yīng)注意該細(xì)胞的資料。

三、生產(chǎn)工藝研究

（一）生產(chǎn)工藝的主要技術(shù)參數(shù)

1．病毒與細(xì)胞的接種比例，MOI的最佳參數(shù)。

2．細(xì)胞培養(yǎng)和病毒培養(yǎng)的最佳溫度、培養(yǎng)時(shí)間和收獲時(shí)間。

3．病毒液的收獲

鑒于Vero作培養(yǎng)基質(zhì)時(shí)，后續(xù)純化工藝去除細(xì)胞DNA時(shí)的困難，因此建議不作細(xì)胞凍化以提高病毒收獲的做法。

4．滅活或裂解條件及滅活效果的驗(yàn)證

鑒于SARS病毒的強(qiáng)感染和強(qiáng)傳播特性，滅活劑的選擇和滅活效果的驗(yàn)證尤為重要，建議如下：

·滅活劑

根據(jù)其他疫苗的滅活經(jīng)驗(yàn)，一般情況下可采用甲醛、β-丙內(nèi)酯或其他有效的滅活劑，如選擇甲醛，其濃度、滅活的作用時(shí)間、作用溫度、pH等條件對(duì)疫苗的抗原的活性具有較大的影

響，在研究中應(yīng)引起注意；

如用β-丙內(nèi)酯應(yīng)使用95%以上濃度的新試劑，β-丙內(nèi)酯保存時(shí)間過長引起自身聚合，影響滅活效果。β-丙內(nèi)酯由于能在疫苗液體中完全水解，不必考慮在成品疫苗中的殘留，因此可考慮在純化前低劑量預(yù)滅活一次，提高生產(chǎn)工序時(shí)的安全性，在純化后再滅活一次以確保完全滅活。

·滅活效果的驗(yàn)證

提供病毒滅活驗(yàn)證的詳細(xì)資料?？刹捎妹舾屑?xì)胞Vero E6盲傳3代，每代用直接免疫熒光驗(yàn)證無活病毒。

5．病毒液的濃縮和/或活性抗原的提取純化，可考慮用膜過濾法濃縮和柱層析法或區(qū)帶離心法純化或其他有效方法。建議參照其他純化疫苗的要求，對(duì)疫苗的總蛋白含量進(jìn)行控制。

6．佐劑

目前能用于疫苗的佐劑僅為鋁佐劑，而鋁佐劑通常使疫苗產(chǎn)生的抗體滯后，且增加注射局部的副反應(yīng)機(jī)率。如疫苗的抗原量能滿足免疫的需要，建議不加佐劑。

（二）滅活疫苗的安全性（免疫感染增強(qiáng)作用）

鑒于呼吸道病毒感染的疫苗預(yù)防（麻疹病毒、呼吸道合胞病毒等）易產(chǎn)生滅活疫苗導(dǎo)致免疫感染增強(qiáng)的病理反應(yīng)，因此，本滅活疫苗須排除免疫感染增強(qiáng)作用的潛在危險(xiǎn)，為本滅活疫苗的研究、實(shí)驗(yàn)和今后的安全使用提供依據(jù)。

但是目前沒有明確的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型可以驗(yàn)證有無免疫感染增強(qiáng)作用，為此建議： 可用猴體接種滅活疫苗后再攻擊SARS病毒，一定時(shí)間后測(cè)定猴體是否產(chǎn)生病毒血癥、臟器是否減少或無病毒抗原、以及作組織病理學(xué)和免疫病理學(xué)等檢查，可以得到初步的證據(jù)。另外也可考慮用家兔、小鼠等別的動(dòng)物進(jìn)行免疫感染增強(qiáng)作用的初步驗(yàn)證。

四、生產(chǎn)的安全性問題

鑒于SARS病毒的強(qiáng)傳播和強(qiáng)感染性的生物學(xué)特性，生產(chǎn)工藝應(yīng)嚴(yán)格按活病毒和滅活后兩部分分開進(jìn)行，活病毒操作區(qū)必須在P3以上生物安全條件下進(jìn)行，嚴(yán)格執(zhí)行國家的有關(guān)規(guī)定。

五、其他

（一）按我國《藥品注冊(cè)管理辦法》中預(yù)防用生物制品的技術(shù)要求完成相關(guān)的研究。

（二）本技術(shù)要點(diǎn)將根據(jù)對(duì)SARS研究的進(jìn)展情況適時(shí)進(jìn)行修訂。

附件2：

細(xì)胞模型篩選抗SARS病毒藥物試驗(yàn)技術(shù)要求

新近發(fā)現(xiàn)的非典型肺炎的病原SARS病毒，目前尚沒有理想的動(dòng)物模型可用于對(duì)抗SARS病毒藥物的篩選。為此用細(xì)胞模型篩選研究抗SARS病毒的藥物，對(duì)評(píng)價(jià)藥物抗病毒活性或效果具有重要提示價(jià)值。為規(guī)范細(xì)胞模型抗SARS病毒藥物的篩選研究，制定本技術(shù)要求。

本技術(shù)要求適用于化藥、中藥、生物制品等擬用于SARS治療或預(yù)防藥物（不包括預(yù)防用疫苗），并將根據(jù)SARS病毒學(xué)研究的進(jìn)展適時(shí)修訂。

一、試驗(yàn)材料要求

（一）病毒

1．毒株：應(yīng)采用SARS流行期臨床分離且經(jīng)相關(guān)部門確證的SARS病毒毒株（建議選用2-3株）。

2．毒種庫：試驗(yàn)前將病毒先在敏感細(xì)胞上傳數(shù)代，增加毒力，待毒力穩(wěn)定后，收獲病毒分裝一定數(shù)量的小管，在-80℃低溫冰箱或液氮冷凍保存?zhèn)溆谩?/span>

3．檢定：毒種庫毒種須經(jīng)外源因子檢測(cè)合格后方可用于篩選試驗(yàn)，每次試驗(yàn)取一支，不得回凍再用于篩選。

（二）細(xì)胞

1．細(xì)胞株：選用對(duì)SARS病毒敏感的傳代細(xì)胞株，如Vero E6、2BS細(xì)胞等。

2．細(xì)胞庫：收集大量培養(yǎng)的細(xì)胞分管液氮凍存以保留足夠的

傳代細(xì)胞。試驗(yàn)前先復(fù)蘇細(xì)胞傳數(shù)代，使培養(yǎng)細(xì)胞生長旺盛穩(wěn)定后，

開始接種細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行試驗(yàn)。

3．檢定：細(xì)胞庫細(xì)胞須經(jīng)外源因子檢測(cè)合格后方可用于篩選試驗(yàn)，每次試驗(yàn)取一支，不得回凍再用于篩選。

（三）待測(cè)藥物

試驗(yàn)前編號(hào)登記、標(biāo)明藥名、來源、批號(hào)、重量或體積、溶媒、溶解度、穩(wěn)定性和保存條件等。

（四）其他

本試驗(yàn)研究必須在生物安全3級(jí)試驗(yàn)室進(jìn)行，毒種的管理使用必須符合國家的有關(guān)規(guī)定。

二、篩選試驗(yàn)

（一）預(yù)備試驗(yàn)

1．病毒毒力測(cè)定

選擇敏感細(xì)胞用于病毒培養(yǎng)，加入10倍系列稀釋的5-7個(gè)濃度的病毒培養(yǎng)液。適宜條件下培養(yǎng)后每天用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞病變（CPE）或用MTT染色法觀察細(xì)胞存活狀態(tài)，用Reed-Muench法計(jì)算病毒半數(shù)感染劑量（TCID50），每濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)確定毒力。

2．藥物對(duì)細(xì)胞毒性的測(cè)定

以細(xì)胞病變或MTT染色法為觀察指標(biāo)，前法可觀察3-5天，每個(gè)藥物至少設(shè)4個(gè)濃度進(jìn)行測(cè)定，用Reed-Muench法求出對(duì)細(xì)胞無毒的最大濃度（TD0）和半數(shù)中毒濃度（TD50）。每濃度藥液至少3管，重復(fù)試驗(yàn)3次。

（二）篩選試驗(yàn)

經(jīng)預(yù)試驗(yàn)求出病毒的TCID50和藥物的TD0后，在SARS病毒的敏感細(xì)胞模型上進(jìn)行抗病毒活性篩選，適宜的培養(yǎng)液及培養(yǎng)條件培養(yǎng)。96孔板，細(xì)胞長成單層后，每孔加100μl （100 TCID50左右）病毒感染，吸附2小時(shí)后，傾出病毒。然后加入待測(cè)藥物，只做一個(gè)最大無毒濃度（TD0），4個(gè)孔。試驗(yàn)設(shè)病毒對(duì)照、細(xì)胞對(duì)照及陽性藥物對(duì)照。以病毒對(duì)照孔出現(xiàn)病變達(dá)75%以上（即4+時(shí)），可終止試驗(yàn)。

倒置顯微鏡觀察對(duì)細(xì)胞的致病變作用（CPE），將給藥孔與病毒對(duì)照孔進(jìn)行比較，如最大無毒濃度藥物無抑制病毒CPE作用則不繼續(xù)做，如有抑制作用須進(jìn)行補(bǔ)充試驗(yàn)。

（三）補(bǔ)充試驗(yàn)

最大無毒濃度（TD0）的藥物如有抗病毒作用，應(yīng)進(jìn)行補(bǔ)充篩選試驗(yàn)。模型和培養(yǎng)條件同上。

試驗(yàn)設(shè)藥物試驗(yàn)組、病毒對(duì)照組及細(xì)胞對(duì)照組。每孔加入100TCID50左右病毒感染，吸附2小時(shí)，傾出病毒。選用最大無毒濃度（TD0）藥液，2倍或者10倍系列稀釋的5-7個(gè)濃度，每濃度4孔，每孔100μl，分別加入未感染或感染的細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)，每天用倒置顯微鏡觀察，記錄細(xì)胞病變程度。當(dāng)病毒對(duì)照病孔病變達(dá)4+時(shí)可終止試驗(yàn)，判定藥物的效果。試驗(yàn)須重復(fù)3次。

用CPE法，對(duì)各組進(jìn)行比較。

用Reed-Muench法計(jì)算半數(shù)有效濃度（IC50）及治療指數(shù)（TI）。

TI = 半數(shù)中毒濃度（TD50）/半數(shù)有效濃度（IC50）

以上初篩及進(jìn)一步藥效評(píng)價(jià)方法一般是針對(duì)治療性給藥（病毒感染細(xì)胞后給藥）的藥物；若為預(yù)防性藥物，則建議相應(yīng)調(diào)整給藥與感染的順序（病毒感染前給藥，病毒感染時(shí)及感染后均應(yīng)洗去藥物），以考察其預(yù)防效果。

三、結(jié)果評(píng)價(jià)

鑒于目前SARS疾病的理想動(dòng)物模型尚未建立，且體內(nèi)外藥效學(xué)結(jié)果的相關(guān)性尚不明確，體外藥效學(xué)的試驗(yàn)結(jié)果僅是評(píng)價(jià)藥物療效重要參考指標(biāo)。在這種情況下,盡量提供更多的反映藥物體內(nèi)外相關(guān)性的研究資料將有助于進(jìn)一步的評(píng)價(jià);如在可能的情況下,進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)研究,考察體內(nèi)藥物濃度能否達(dá)到IC50及維持時(shí)間等。另外，還應(yīng)結(jié)合受試藥物的安全性，對(duì)其有效性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

附件3：

SARS診斷試劑生產(chǎn)研制技術(shù)要求

由于對(duì)引發(fā)嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥（簡稱SARS）的病原－新型冠狀病毒的研究尚有待進(jìn)一步深入，診斷試劑的研究仍存在很多不確定因素。為規(guī)范SARS診斷試劑的研究，特制訂本技術(shù)要求。

一、基本要求

（一）從事SARS體外生物診斷試劑研發(fā)的機(jī)構(gòu)應(yīng)當(dāng)具有與試驗(yàn)研究項(xiàng)目相適應(yīng)的人員、場(chǎng)地及設(shè)施等條件。

（二）SARS病毒的分離、管理、使用及其保藏、運(yùn)輸、處理等必須按照國家有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。

（三）臨床研究必須符合GCP的原則及相關(guān)的技術(shù)要求。

二、原材料

（一）抗體檢測(cè)試劑

1．抗原：由于對(duì)新型冠狀病毒的基礎(chǔ)研究尚有待深入，為此所用抗原應(yīng)盡可能選擇檢測(cè)譜廣的抗原，如純化的全病毒抗原。

2．抗原來源明確，質(zhì)量指標(biāo)必須達(dá)到診斷試劑研制用的

要求。

3．病毒株須經(jīng)鑒定并確證。

4．其他輔助材料必須符合相關(guān)的技術(shù)要求。

5．包被用全病毒抗原或陽性質(zhì)控血清須進(jìn)行滅活驗(yàn)證研究。

6．陽性質(zhì)控血清須進(jìn)行中和試驗(yàn)驗(yàn)證研究。

（二）核酸檢測(cè)試劑

1．引物的設(shè)計(jì)須符合核酸檢測(cè)設(shè)計(jì)的要求。

2．靶序列需進(jìn)行與其他病毒同源性的分析對(duì)比研究。

3．檢測(cè)試劑須設(shè)定合理的內(nèi)標(biāo)和外標(biāo)。

4．試劑須設(shè)置抗污染的特定措施。

5．?dāng)U增產(chǎn)物須進(jìn)行確證研究。

（三）抗原檢測(cè)試劑

1．可采用單克隆或者多克隆抗體的雙抗體檢測(cè)法。

2．抗體須經(jīng)特異性交叉反應(yīng)測(cè)定。

三、工藝與生產(chǎn)

（一）工藝過程須進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)研究。

（二）生產(chǎn)人員須經(jīng)專業(yè)知識(shí)培訓(xùn)，了解有關(guān)SARS的基本知識(shí)。

（三）生產(chǎn)車間須符合《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》的要求。

四、質(zhì)量控制

（一）應(yīng)制定嚴(yán)格的原材料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，保證批與批間的一致性。

（二）應(yīng)研究制定企業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及參考品，用于對(duì)試劑的質(zhì)量控制。

（三）試劑盒須進(jìn)行成品性能的評(píng)價(jià)。

五、臨床研究

（一）研究用樣品必須有明確、詳細(xì)的臨床資料，包括病程等；樣品中須有一定數(shù)量的陽轉(zhuǎn)系列標(biāo)本。

（二）須經(jīng)過至少兩家臨床研究單位進(jìn)行臨床考核，出具臨床考核報(bào)告并加蓋臨床考核單位有效公章。

（三）研究用試劑須經(jīng)中國藥品生物制品檢定所檢定合格后方可用于臨床研究。

（四）檢測(cè)時(shí)應(yīng)采用雙盲或者單盲，陰性樣品和陽性樣品須在符合相關(guān)規(guī)定的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際評(píng)價(jià)條件下同時(shí)進(jìn)行測(cè)定。

（五）核酸檢測(cè)試劑標(biāo)本如血清或者唾液等，陽性數(shù)量分別不少于200份，同一類型陰性樣品不少于400份。

（六）對(duì)酶聯(lián)免疫診斷試劑，不同類型的陽性、陰性樣品均不少于400份。

（七）其他方法的SARS診斷試劑，不同類型的陽性、陰性樣品的數(shù)量均不得少于300份。

（八）檢測(cè)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以病程10天劃分，不同病程的病例（樣本）數(shù)應(yīng)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

六、其他

（一）SARS診斷試劑的生產(chǎn)研制必須符合《中華人民共和國傳染病防治法》的相關(guān)要求。

（二）產(chǎn)品使用說明書需明確標(biāo)注試劑檢測(cè)的局限性。

（三）本技術(shù)要求將根據(jù)對(duì)SARS研究的進(jìn)展情況適時(shí)進(jìn)行修訂。

附件4：

SARS病毒毒株資料登記表

一、病毒株名稱：

二、宿主情況：

- 病人姓名

- 病人年齡

- 病人性別

- 病人民族

- 病人家庭住址

- 發(fā)病地點(diǎn)

- 發(fā)病日期

- 收住入院日期

- 臨床確診日期

- 實(shí)驗(yàn)室確診日期

- 病人病程

- 病人轉(zhuǎn)歸　　　　　死亡　　　痊愈　　　是否有后遺癥

- 病人密切接觸者病人數(shù)

- 毒株分離原樣本：

咽試子　　漱口液　　　痰液　　　血液　　　糞便　　　尸解標(biāo)本的組織名稱

- 取樣日期

- 取樣時(shí)病人的病期

- 取樣地點(diǎn)

- 病人是否留有恢復(fù)期血清

如有：采血日期

血清量　　　　ml　　　　支

三、毒株分離過程

分離用細(xì)胞

細(xì)胞名稱

細(xì)胞代次

細(xì)胞來源

培養(yǎng)基名稱

分離用動(dòng)物

動(dòng)物名稱

動(dòng)物品系

動(dòng)物年齡

飼養(yǎng)條件

病毒分離傳代

樣品處理方法

首次盲傳確證病毒陽性代次

病毒確證檢定方法

每代培養(yǎng)天數(shù)

細(xì)胞是否產(chǎn)生病變

病變模式（如有請(qǐng)?zhí)峁┱掌?/span>

病毒滴度

滴定方法

四、毒種建立和保存

毒種存儲(chǔ)條件　　　-20℃　　　-40℃ 　　　-60℃　　　-80℃

原始毒種代次

分裝毒種用容器名稱

分裝毒種用容器材料

分裝毒種用容器體積

毒種病毒滴度

毒種添加的保護(hù)劑

人白蛋白　　%

牛血清　　　%

其他保護(hù)劑

原始毒種批數(shù)量　　　ml　　　支

該株毒種的其他代次

數(shù)量　　　ml　　　支

如已凍干

寫明凍干條件

五、毒種的檢定

毒種的鑒別實(shí)驗(yàn)

檢定方法

檢定日期

檢定結(jié)果

毒種的無菌試驗(yàn)

檢定方法

檢定日期

檢定結(jié)果

毒種的序列測(cè)定

測(cè)定方案

測(cè)定方法

測(cè)定日期

實(shí)驗(yàn)室名稱

測(cè)定結(jié)果　　附：核酸序列圖

推導(dǎo)的氨基酸序列圖

種系發(fā)生樹圖

六、分離病毒的P3實(shí)驗(yàn)室

面積

所在地址

郵政編碼

電話

傳真

實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人姓名　　　　職稱　　　　　職務(wù)

E-mail：

手機(jī)

上級(jí)主管部門

負(fù)責(zé)人（簽章）